Методика и техника определения групповой принадлежности крови человека

Сыворотка крови, содержащая тот или иной агглютинин, вполне пригодна в качестве реактива для установления наличия или отсутствия в исследуемых эритроцитах соответствующего (т. е. относящегося к той же агглютинационной паре) агглютиногена.

Так, например, если сывороткой крови второй группы, содержащей агглютинин анти-В (β), обработать по установленной методике ряд образцов эритроцитов крови от разных лиц, то реакция агглютинации наступит именно с теми образцами эритроцитов, которые содержат соответствующий агглютиноген, в данном случае агглютиноген В. В тех же образцах крови, которые содержат агглютиноген, относящийся к другой агглютинационной паре (т. е. агглютиноген А), или вовсе не содержат агглютиногена, реакция агглютинации не наступит.

Аналогичное явление наблюдается, если в тех же целях пользоваться сывороткой третьей группы, содержащей агглютинин анти-А (α). В этом случае при исследовании ряда образцов эритроцитов крови от разных лиц агглютинация наступит лишь тогда, когда исследуемые эритроциты содержат агглютиноген А. Во всех прочих случаях, где в исследуемых эритроцитах содержится агглютиноген другой агглютинационной пары или вовсе отсутствует, агглютинация не наступит.

Если исследовать ряд образцов эритроцитов крови сывороткой крови первой группы, содержащей оба агглютинина, то реакция агглютинации возникает со всеми образцами эритроцитов крови, содержащими тот или иной агглютиноген или оба вместе.

Таким образом, ни одна из сывороток крови, содержащих тот или иной агглютинин или оба вместе, не пригодна для определения групповой принадлежности эритроцитов при условии самостоятельного их применения.

Вместе с тем при одновременном (параллельном) применении сыворотки, содержащей фактор анти-А, и сыворотки, содержащей фактор анти-В, может быть выявлен любой из четырех вариантов распределения изоагглютиногенов в эритроцитах крови человека. Никакая другая пара сывороток не может дать такого результата, в чем легко убедиться при соответствующем сопоставлении полученных данных. Именно поэтому сыворотки второй и третьей группы крови получили название стандартных изогемагглютинирующих сывороток.

Хотя для определения групповой принадлежности эритроцитов вполне достаточно параллельное применение стандартных гемагглютинирующих сывороток, т. е. сывороток крови второй и третьей группы, однако на практике закрепилась методика определения групповой принадлежности эритроцитов тремя сыворотками. При этом в исследование, помимо сывороток второй и третьей группы, включается также сыворотка крови первой группы, содержащая оба агглютинина: анти-А (α) и анти-В (β). Сыворотка эта по своим серологическим свойствам не является стандартной, однако включение ее в комплект рабочих сывороток для определения групповой принадлежности эритроцитов представляет большую практическую ценность. Сыворотка крови группы 0 (I) является в этом случае контрольной, так как результат взаимодействия данной сыворотки с испытуемыми эритроцитами не должен противоречить результату, полученному с помощью стандартных сывороток. В случае несоответствия полученных серологических данных от применения стандартных сывороток и контрольной сыворотки необходимо в обязательном порядке повторное определение групповой принадлежности исследуемых эритроцитов с особой тщательностью новым комплектом сывороток.

Рис. 4. Схема определения групповой принадлежности эритроцитов по стандартным и контрольной гемагглютинирующим сывороткам

Таким образом, сыворотка крови группы 0 (I) вносит в методику определения групповой принадлежности эритроцитов элемент самопроверки, что имеет очень большое значение ввиду огромной практической важности пробы на групповую принадлежность эритроцитов. В силу этих же соображений при определении групповой принадлежности крови рекомендуется (по инструкции) пользоваться двумя комплектами сывороток различных серий, по три сыворотки (первой, второй и третьей группы) в каждом комплекте.

На рис. 4 дана схема определения групповой принадлежности эритроцитов тремя сыворотками (стандартными и контрольной). В этой схеме предусмотрено восемь возможных результатов, выявляющих ход исследования и сигнальное значение сыворотки крови первой группы.

1. В каплях смеси исследуемых эритроцитов с обеими стандартными и с контрольной сыворотками агглютинация не наступила. Результат определения по стандартным сывороткам свидетельствует о том, что исследуемые эритроциты не содержат вовсе агглютиногенов. Результат определения по контрольной сыворотке не противоречит этим данным. Контрольная сыворотка, содержащая оба агглютинина, также не дала феномена агглютинации; следовательно, можно с уверенностью считать, что исследуемые эритроциты действительно не содержат агглютиногенов и должны быть отнесены, таким образом, к первой группе - 0(I).

2. По стандартным сывороткам в исследуемых эритроцитах обнаружен агглютиноген А. Контрольная сыворотка вызвала в испытуемых эритроцитах феномен агглютинации. В этом случае агглютинация, полученная с контрольной сывороткой, не подтверждает и не может подтвердить принадлежность испытуемых эритроцитов именно к группе А (II), так как контрольная сыворотка 0(I) содержит оба агглютинина и дает феномен агглютинации с любыми эритроцитами, содержащими тот или иной, или оба агглютиногена. Однако агглютинация, возникшая в капле с контрольной сывороткой, не противоречит результату определения по стандартным сывороткам, вследствие чего результат этот может рассматриваться как истинный.

3. По стандартным сывороткам в исследуемых эритроцитах обнаружен агглютиноген В. Контрольная сыворотка вызвала в испытуемых эритроцитах феномен агглютинации, что не противоречит результату определения по стандартным сывороткам, вследствие чего результат этот может рассматриваться как истинный.

4. В каплях смеси испытуемых эритроцитов с обеими стандартными и контрольной сыворотками наступила агглютинация. Результат по стандартным сывороткам свидетельствует о том, что в испытуемых эритроцитах содержатся оба агглютинина. Агглютинация, возникшая в капле с контрольной сывороткой, не противоречит этим данным, вследствие чего результат определения по стандартным сывороткам может рассматриваться как соответствующий действительности.

Первые четыре ряда на рис. 4 являются образцами нормального хода пробы на групповую принадлежность эритроцитов с применением комплекта в три сыворотки. Подобный ход реакции свидетельствует о доброкачественности сывороток как стандартных, так и контрольной, и о точном соблюдении предусмотренных инструкцией требований по методике и технике определения групповой принадлежности эритроцитов. Однако в ходе определения групповой принадлежности эритроцитов комплектом в три сыворотки могут обнаруживаться по различным причинам и несоответствия. Встречающиеся на практике варианты несоответствия представлены в последних четырех рядах на рис. 4.

5. По стандартным сывороткам в исследуемых эритроцитах агглютиногены вовсе не обнаруживаются; между тем в капле с контрольной сывороткой группы 0 (I) получена агглютинация, что свидетельствует о наличии в испытуемых эритроцитах того или иного агглютиногена, а возможно, и обоих агглютиногенов. Таким образом, результаты, полученные по стандартным сывороткам и по контрольной, - не соответствующие, противоречивые результаты. Групповая принадлежность исследуемых эритроцитов по такому результату исследования не может быть установлена.

6. По стандартным сывороткам в испытуемых эритроцитах обнаружен фактор А; однако в капле с контрольной сывороткой группы 0 (I) агглютинация не наступила, хотя сыворотка эта содержит оба агглютинина. В этом варианте, следовательно, также имеется несоответствие результатов по стандартным и контрольной сывороткам, в связи с чем по полученному результату исследования групповая принадлежность испытуемых эритроцитов также не может быть установлена.

7. По стандартным сывороткам в исследуемых эритроцитах обнаружен фактор В; между тем в капле смеси сыворотки 0 (I) с этими же эритроцитами агглютинация не наступила, что противоречит результатам, полученным со стандартными сыворотками. При таком несоответствии данных групповая принадлежность испытуемых эритроцитов остается неустановленной.

8. По стандартным сывороткам в испытуемых эритроцитах обнаружены оба агглютиногена, что дает основание для заключения о принадлежности испытуемых эритроцитов к четвертой группе - AB(IV). Однако в капле смеси этих эритроцитов с контрольной сывороткой группы 0 (I), содержащей оба агглютинина, агглютинация не наступила вовсе. Результат этот не соответствует, противоречит данным, полученным со стандартными сыворотками. При таком результате исследования вопрос о групповой принадлежности испытуемых эритроцитов остается неразрешенным.

Таким образом, методика определения групповой принадлежности эритроцитов комплектом в три сыворотки открывает возможности для сопоставления результатов исследования по стандартным сывороткам и по контрольной сыворотке. Такое сопоставление данных позволяет в отдельных случаях выявить ложный характер заключения о групповой принадлежности исследуемых эритроцитов по стандартным сывороткам, вследствие чего методика исследования тремя сыворотками имеет несомненные преимущества перед методикой исследования только лишь двумя (стандартными) сыворотками. При обнаружении несоответствия необходимы повторные, методически и технически тщательно проведенные определения групповой принадлежности эритроцитов различными комплектами достаточно свежих сывороток с титром агглютининов не ниже 1:32.

При тщательной проверке обычно удается выяснить источник ошибки и тем самым внести ясность в результат исследования.

Для установления полной формулы групповой принадлежности крови недостаточно определить групповые факторы эритроцитов, необходимо также определить и групповые факторы сыворотки крови. Сыворотка крови, так же как и эритроциты крови, имеет свои отличительные групповые свойства, для установления которых требуются определенные стандартные реактивы. Такими реактивами являются стандартные эритроциты, относящиеся, как и стандартные сыворотки, ко второй и третьей группе. При определении групповых свойств сыворотки эритроциты группы 0 (I) также являются контрольными и имеют то же назначение, что и сыворотка группы 0 (I) при определении групповых свойств эритроцитов. На рис. 5 представлен ход определения групповой принадлежности сыворотки по стандартным и контрольным эритроцитам (рис. 5).

Рис. 5. Схема определения групповой принадлежности сыворотки по стандартным и контрольным эритроцитам

1. Испытуемая сыворотка агглютинирует обе разновидности стандартных эритроцитов, как содержащие фактор А, так и содержащие фактор В. Между тем данная сыворотка не агглютинирует эритроцитов группы 0 (I), не содержащей агглютиногенов. Такой результат пробы свидетельствует о том, что испытуемая сыворотка «работает» как специфическая сыворотка, ибо с контрольными эритроцитами 0 не дает агглютинации вовсе. Испытуемая сыворотка относится, таким образом, к группе 0 (I), так как по ходу пробы содержит оба агглютинина (анти-А и анти-В).

2. Испытуемая сыворотка агглютинирует эритроциты, содержащие агглютиноген В. Сыворотка не агглютинирует эритроцитов А и эритроцитов 0. Таким образом, испытуемая сыворотка «работает» специфически. Следовательно, сыворотка эта содержит действительно лишь один агглютинин - агглютинин анти-В и относится в соответствии с этим серологическим свойством ко второй группе.

3. Испытуемая сыворотка агглютинирует стандартные эритроциты, содержащие фактор А, но не агглютинирует эритроцитов В и эритроцитов 0. Эти данные свидетельствуют о специфическом характере агглютинации с эритроцитами А. Таким образом, испытуемая сыворотка содержит один агглютинин, а именно агглютинин анти-А и, следовательно, относится к третьей группе.

4. Испытуемая сыворотка не обнаруживает вовсе агглютинационных свойств; агглютинация не наступила ни в капле смеси этой сыворотки с эритроцитами А, ни в капле смеси с эритроцитами В. Агглютинация также не наступила в капле смеси этой сыворотки с эритроцитами 0. Эти данные свидетельствуют о том, что в испытуемой сыворотке вовсе нет специфических агглютининов. Такая сыворотка относится к четвертой группе.

5. Испытуемая сыворотка агглютинирует эритроциты А и эритроциты В. Вместе с тем сыворотка агглютинирует также и эритроциты 0, не содержащие вовсе групповых агглютиногенов. Подобное явление (агглютинация эритроцитов 0) возможно в случае, если испытуемая сыворотка в силу тех или иных ее особенностей дает феномен ложной, неспецифической агглютинации или, помимо агглютинации истинной, способна давать также и ложную агглютинацию. В этих условиях, естественно, не может быть уверенности, что агглютинация, наступившая в капле смеси испытуемой сыворотки со стандартными эритроцитами, есть именно агглютинация истинная, специфическая, т. е. результат взаимодействия определенного антигена и соответствующего антитела. Агглютинация эта может быть и ложной, т. е. результатом неспецифических изменений стойкого или временного характера в физической структуре или в химическом составе сыворотки. При таком результате исследования групповая принадлежность испытуемой сыворотки не может быть установлена и остается, следовательно, под вопросом.

6. Испытуемая сыворотка дает феномен агглютинации в капле смеси с эритроцитами В. В капле смеси с эритроцитами А агглютинации не обнаруживается. Вместе с тем испытуемая сыворотка дает также агглютинацию и с эритроцитами 0, что следует рассматривать как феномен ложной агглютинации. Отсутствие подобного же явления (ложной агглютинации) в капле смеси испытуемой сыворотки с эритроцитами А не противоречит такому заключению, так как и ложная агглютинация в отдельных случаях может иметь избирательный характер в зависимости от биофизико-химических особенностей среды, в которой эта реакция протекает. Таким образом, результат реакции испытуемой сыворотки со стандартными эритроцитами остается под сомнением и в том случае, если агглютинация наступила лишь с одной разновидностью стандартных эритроцитов, поскольку агглютинация с эритроцитами 0 все же наступила. В подобном случае групповая принадлежность испытуемой сыворотки также не может быть установлена и остается под вопросом.

7. Испытуемая сыворотка дает агглютинацию с эритроцитами А. С эритроцитами В агглютинация не наступает. Вместе с тем испытуемая сыворотка дает четкий феномен агглютинации с эритроцитами 0. В этом случае в соответствии с изложенными выше соображениями возникает сомнение в истинном, т. е. специфическом характере агглютинации испытуемой сыворотки с эритроцитами А. В этих условиях групповая принадлежность испытуемых эритроцитов не может быть установлена.

8. Испытуемая сыворотка не дает агглютинации ни с эритроцитами А, ни с эритроцитами В. Следовательно, по стандартным эритроцитам сыворотка относится к четвертой группе. Однако испытуемая сыворотка дает агглютинацию с эритроцитами 0. Агглютинация эта несомненно ложная, так как эритроциты 0 не содержат вовсе групповых агглютиногенов. Все же по такому результату исследования не представляется возможным установить групповую принадлежность испытуемой сыворотки только лишь по ходу пробы со стандартными эритроцитами, так как сыворотка, обнаруживающая свойство псевдоагглютинации, хотя и сохраняет факторы специфической агглютинации, но нередко с очень низким титром, что может привести к просмотру истинной агглютинации вследствие ее слабой морфологической выраженности. Следовательно, и при этом варианте результата исследования групповая принадлежность испытуемой сыворотки не может быть с достоверностью установлена.

Методика определения групповых свойств испытуемой сыворотки по трем каплям открывает возможность для сравнительной оценки результатов исследования по стандартным эритроцитам и по контрольным. Благодаря этому в ряде случаев удается своевременно обнаружить феномен ложной агглютинации вследствие наличия в испытуемой сыворотке псевдоагглютининов. В подобных случаях для установления групповой принадлежности испытуемой сыворотки необходимы повторные исследования сыворотки новыми комплектами стандартных и контрольных эритроцитов при строжайшем соблюдении требований инструкции по определению групповой принадлежности крови, в результате чего обычно удается снять феномен ложной агглютинации вовсе или четко отдифференцировать агглютинацию истинную, специфическую от агглютинации ложной, неспецифической.

Рис. 6. Предметы, необходимые для определения групповой принадлежности крови. 1 - стандартные сыворотки двух комплектов и различных серий; 2 - стандартные эритроциты; 5 - игла Франка; 4 - физиологический раствор; 5 - винный спирт; 6 - вата; 7 - йодная настойка; 8 - предметные стекла (или тарелки); 9 - глазные пипетки; 10 - стеклянные палочки

В настоящее время групповая принадлежность эритроцитов и сыворотки в каждом случае определяется по методике трех капель. Для определения групповой принадлежности крови требуется соответствующее исследование как эритроцитов, так и сыворотки (или плазмы) крови. При определении групповой принадлежности крови у донора в обязательном порядке проводятся обе эти пробы. При определении групповой принадлежности крови у реципиента обычно ограничиваются исследованием капли крови больного по стандартным и контрольной сывороткам. Следует пользоваться при этом двумя комплектами сывороток всех трех групп, причем сыворотки должны быть различных серий в каждом комплекте. Для определения групповых факторов крови необходимо иметь под руками всегда одни и те же предметы, вследствие чего целесообразно содержать их в виде готового набора в определенном месте. Предметы, входящие в этот набор, представлены на рис. 6.

Сыворотки эти изготовляются в специальных лабораториях институтов и станций переливания крови постоянным и опытным персоналом в условиях строжайшего соблюдения соответствующей инструкции Министерства здравоохранения СССР. Для определения групповой принадлежности крови разрешается пользоваться только стандартными сыворотками, изготовленными и апробированными в специальных лабораториях. Обычными источниками получения стандартных изогемагглютинирующих сывороток являются донорская кровь, а также «утильная» человеческая кровь, непригодная для переливания.

Выпускаемая специальными лабораториями стандартная сыворотка удовлетворяет определенным требованиям: а) сыворотка специфична, т. е. содержит строго определенные агглютинины (анти-А или анти-В, или оба агглютина); б) сыворотка активна, т. е. аглютинины, содержащиеся в этой сыворотке, дают с соответствующими эритроцитами вполне четко выраженную агглютинацию при достаточно высоком разведении сыворотки физиологическим раствором (не ниже 1:32); в) сыворотка не дает побочных реакций ложной агглютинации; г) по внешнему виду сыворотка светлая и прозрачная; однако небольшое помутнение сыворотки и следы слабого гемолиза не делают ее непригодной; значительное помутнение вследствие каких бы то ни было причин, темная окраска вследствие гемолиза или присутствие других пигментов, прорастание сыворотки, гнилостный запах делают сыворотку непригодной для применения в целях определения групповых факторов крови.

Пригодная для применения стандартная сыворотка ампулируется. Каждая ампула имеет свою этикетку - паспорт с обозначением группы, титра (максимальное разведение, при котором сыворотка дает еще реакцию агглютинации), срока годности, серии и места изготовления. Срок годности стандартной сыворотки - 3 месяца с момента разливки. Сыворотку, срок годности которой истек, допустимо применять, если она сохранила требуемые свойства.

Пригодные к применению стандартные сыворотки должны удовлетворять следующим требованиям: а) сыворотка группы А (II) должна в течение одной минуты агглютинировать эритроциты группы В (III) и отчетливо образовывать при этом крупные зерна; б) сыворотка группы В (III) должна быстро и отчетливо агглютинировать эритроциты группы А (II); в) сыворотка группы 0 (I) должна агглютинировать таким же образом эритроциты группы А (II) и В (III); г) ни одна из стандартных сывороток не должна в течение обычного срока наблюдения (5 минут) агглютинировать эритроциты группы 0 (I); в дальнейшем, уже при подсыпании капли смеси, могут обозначиться некоторые морфологические явления в капле, симулирующие феномен агглютинации; д) ни одна из стандартных сывороток не должна обнаруживать гемолизирующих свойств в отношении эритроцитов какой бы то ни было группы.

Стандартные сыворотки должны храниться в сухом, затемненном помещении (в закрытом ящике или коробке). Температура помещения должна быть прохладной; допустима и комнатная температура, но не выше 20°. Если ампулы сыворотки вскрыты и сыворотку необходимо сохранить для работы в последующие дни, то ампулы следует закрывать ватой и сверху заливать коллодием. В связи с тем, что стандартная сыворотка может непредвиденно снизить свой титр, необходимо в целях предотвращения ошибок при определении групповой принадлежности крови регулярно проверять стандартные сыворотки при их получении в институте или на станции переливания крови, а затем при хранении в лечебном учреждении через каждые 15 дней. Эти сыворотки проверяются в лечебных учреждениях с кровью группы 0 (I), А (II), В (III), взятой у лиц из персонала, групповая принадлежность которых заранее определена и многократно проверена. При выборе этих контрольных лиц должно быть соблюдено обязательное правило: эритроциты лиц, имеющих кровь группы А (II) и В (III), должны давать быструю и отчетливую реакцию агглютинации. По предложению ЦОЛИПК на этикетках сыворотки группы А (II) ставятся по диагонали две голубые полоски, на этикетках сыворотки группы В (III) - три светло-красные полоски. Окрашивание самой сыворотки запрещается.

Для приготовления стандартных эритроцитов берут кровь из пальца у лиц, имеющих кровь группы 0 (I), А (II), В (III), причем групповая принадлежность этих лиц должна быть тщательно проверена. Кровь набирается в пробирку с раствором лимоннокислого натрия (4%) примерно с расчетом на один объем раствора - три объема крови. Смесь центрифугируется, после чего плазма отсасывается. Этритроциты используются для определения групповых факторов сыворотки исследуемой крови.

Применение физиологического раствора строго обязательно при определении групповых факторов эритроцитов или сыворотки. С помощью этого раствора, как правило, удается отличить агглютинацию истинную от ложной (см. ниже методику определения групповой принадлежности эритроцитов).

Тарелки или предметные стекла. Пробу на групповую принадлежность удобно производить на белом фоне. На этом фоне более отчетливо обнаруживается агглютинация, в особенности если феномен морфологически протекает не с предельной демонстративностью.

В силу этого обстоятельства при определении групповой принадлежности крови довольно широко пользуются тарелками. Тарелкой также очень удобно манипулировать при оценке результатов реакции гемагглютинации.

Капли сыворотки следует наносить на тарелку в виде треугольника, на вершину которого наносится капля сыворотки группы 0 (I), а на основание - слева направо - по капле сывороток группа А (II) и В (III).

Для большей четкости в работе рекомендуется на поля тарелки в соответствующих точках наносить запись условных обозначений сывороток. Поскольку при определении групповой принадлежности крови пользуются двумя комплектами сывороток, следует карандашом делить тарелку на два поля - верхнее и нижнее. При применении предметных стекол капли сывороток наноcятся слева направо в порядке их нумерации. Капли следует наносить на предметные стекла несколько выше продольной оси предметного стекла, что является удобным условным знаком для определения правильного (исходного) положения предметного стекла при манипуляции им или при передаче его из рук в руки. Менее удобно надписывать на стекле условные обозначения стандартных сывороток. Предметные стекла должны быть хорошо обезжирены.

Игла Франка. Эта игла очень удобна, так как позволяет предопределять глубину укола. Можно пользоваться, естественно, и другими колющими предметами (игла, булавка, перо). Следует, однако, отметить, что процедуры укола много легче переносятся при применении иглы Франка.

Глазные пипетки и стеклянные палочки. Сыворотку следует извлекать из ампулы с помощью глазных пипеток. Пользуясь пипеткой, всегда можно получить на тарелке или стекле округлую, равномерную каплю определенного диаметра. Рекомендуется пользоваться индивидуальной пипеткой для каждой ампулы сыворотки (шесть пипеток в наборе). Целесообразно иметь на каждой пипетке наклейку с указанием группы и серии ампулы сыворотки. Стеклянные палочки необходимы для перенесения капли крови с пальца на тарелку или предметное стекло и для помешивание капли смеси сыворотки и эритроцитов.

Рекомендуется для каждой капли смеси пользоваться отдельной палочкой.

Вата, спирт и йодная настойка необходимы для дезинфекции иглы и места укола. Следует иметь в виду, что для укола требуется сухая игла, а также вполне подсохшее обработанное место предстоящего укола. Первые капли показавшейся крови целесообразно снять ваткой или марлей, чтобы исключить возможность денатурации исследуемой капли крови спиртом.

Для определения групповой принадлежности крови необходимо установить групповые факторы эритроцитов и сыворотки исследуемой крови. Такое определение называется двойным. Групповая принадлежность крови донора всегда определяется двойным способом; при определении групповой принадлежности крови реципиента обычно ограничиваются установлением групповых факторов эритроцитов по стандартным и контрольной сывороткам.

Определение групповой принадлежности эритроцитов крови по стандартным и контрольной сывороткам производится по инструкции следующим образом.

а) На тарелку или предметное стекло в соответствующих точках наносят последовательно различными пипетками по одной крупной, примерно диаметром с 15-20-копеечную монету, капле сыворотки группы 0 (I), А (II) и В (III). Каждую пипетку, после того как из нее выпущена капля сыворотки, немедленно опускают в тот же флакон с сывороткой, из которого эта капля сыворотки была взята.

б) После дезинфекции иглы и пальца наносят укол в мякоть ногтевой фаланги пальца (лучше безымянный левой руки). Стеклянной палочкой, отдельной для каждой капли крови, переносят три малые (примерно величиной с булавочную головку) капли крови рядом с каплями сывороток; перемешивают сыворотку и исследуемую кровь, пока смесь не окрасится в равномерный розовый цвет.

в) Наблюдение за реакцией производится в течение 5 минут (по часам!) независимо от хода реакции.

г) По истечении 5 минут к каждой капле смеси добавляют по одной капле физиологического раствора, вновь перемешивают палочкой, после чего производят окончательную оценку результатов.

При соблюдении указанных методических и технических требований в тех каплях смеси сыворотки и исследуемой крови, в которых имеются факторы одной и той же агглютинационной пары (например, агглютиноген эритроцитов исследуемой крови А и соответствующий этому агглютиногену агглютинин анти-А сыворотки), агглюцинация наступает довольно быстро, обычно уже в первую минуту, и тут же достигает наибольшей морфологической выраженности.

Однако в ряде случаев агглютинация наступает много позже, нарастает медленно и становится вполне демонстративной лишь к исходу предусмотренного срока наблюдения, когда на периферии капли уже могут проявиться первые признаки ее подсыхания. Поэтому никогда не следует торопиться с заключением о результатах исследования до истечения нормального срока

наблюдения, так как при этом возникает опасность просмотра «поздней» реакции.

При замедленном ходе реакции покачивание капли смеси в различных плоскостях, а также повторное помешивание капли смеси свежей стеклянной палочкой, как правило, ускоряют ход реакции.

В случае отсутствия каких-либо признаков агглютинации в течение пятиминутного наблюдения прибавление к капле смеси капли физиологического раствора (с последующим помешиванием) никаких изменений морфологического характера в капле смеси не вызывает; капля смеси приобретает лишь более бледную окраску.

При наличии же феномена агглютинации прибавление капли физиологического раствора (с последующим помешиванием) приводит к заметным морфологическим изменениям в капле. При этом в одних случаях, а именно когда обнаруженная агглютинация является истинной, специфической, морфологическая картина агглютинации становится более яркой, более демонстративной, агглютинаты укрупняются, а в местах, свободных от агглютинатов, капля смеси еще более просветляется. В других же случаях, когда имеет место ложная, неспецифическая агглютинация, морфологическая картина последней становится менее демонстративной, агглютинаты разукрупняются, приобретают характер мелкой зернистости, едва заметной запыленности, которая вовсе может исчезнуть, и капля вновь приобретает гомогенный вид и равномерную окраску. В дальнейшем, при ложной агглютинации, уже при подсыхании капли, мелкая зернистость может вновь появиться и вновь исчезнуть под повторным воздействием капли физиологического раствора.

Обратное развитие морфологической картины ложной агглютинации под воздействием физиологического раствора протекает еще более демонстративно, если пользоваться слегка подогретым физиологическим раствором (до 37°). Оценка результатов реакции изогемагглютинации по стандартным и контрольной сывороткам Дана на рис. 4. Результат пробы просматривается невооруженным глазом.

Определение групповой принадлежности сыворотки (или плазмы) крови по стандартным и контрольным эритроцитам по инструкции проводится следующим образом: у исследуемого лица набирается из пальца кровь в маленькую пробирку с небольшим количеством 4-6% раствора лимоннокислого натрия (одна часть раствора и четыре части крови). Смесь центрифугируется или отстаивается в течение 20-30 минут. Три капли отстоявшейся плазмы наносят на тарелку и к каждой капле плазмы (рядом) прибавляют пипеткой малую каплю (с булавочную головку) эритроцитов группы 0 (I), А (II) и В (III), получаемых от стабилизированной крови после снятия с нее плазмы. Объемные соотношения капли эритроцитов к испытуемой плазме должны быть приблизительно 1:20. Каждую каплю эритроцитов тщательно смешивают с плазмой, тарелку покачивают в течение 5 минут, а затем к каждой капле смеси прибавляют по 1-2 капли физиологического раствора, после чего производят окончательную оценку результатов (рис. 5). Реакция протекает более демонстративно, если вместо плазмы пользоваться сывороткой крови, так как титр антител в сыворотке крови более высокий, нежели в плазме.

При каждом определении группы крови по стандартным сывороткам необходимо пользоваться двумя комплектами сывороток, по три сыворотки в каждом комплекте. Каждая из этих сывороток (всего в количестве шести) должна иметь свой номер серии, не повторяющийся в обоих комплектах. При доброкачественности сывороток и правильном проведении пробы результаты исследования по обоим комплектам сывороток должны полностью совпадать. Применение двух комплектов сывороток открывает возможности для сравнительной оценки результатов исследования по отдельным комплектам сывороток, что вносит новый элемент самоконтроля при определении групповой принадлежности исследуемой крови.

Таким образом, современная методика определения групп крови предусматривает четыре формы самоконтроля в ходе определения: 1) включение контрольной сыворотки группы 0 (I) в каждый комплект сывороток для сравнительной оценки результатов исследования по стандартным сывороткам и по контрольной сыворотке; 2) включение в методику исследования физиологического раствора, с помощью которого представляется возможным отличить агглютинацию истинную от агглютинации ложной; 3) включение в методику исследования второго комплекта сывороток всех трех групп для сравнительной оценки результатов исследования; 4) перекрестное определение групповой принадлежности эритроцитов и сыворотки (или плазмы) исследуемой крови.

При строгом соблюдении методических и технических требований, предусматриваемых инструкцией по определению групп крови, результаты исследования, произведенного по всем перечисленным формам, должны полностью соответствовать и взаимно подтверждать друг друга, в результате чего можно с наибольшей вероятностью считать правильным (соответствующим действительности) определение групповой принадлежности испытуемой крови.

При массовом определении групповой принадлежности группа 0 (I) обнаруживается примерно в 40% исследований, группа А (II) - в 45%, группа В (III) - в 10% и группа AB (IV) - в 5% исследований. Таким образом, фактор А в соответствии с приведенными цифрами обнаруживается примерно у 50%, а фактор В - у 15% людей.

Изоагглютинины по тем же данным обнаруживаются у человека чаще, нежели изоагглютиногены. Так, изоагглютинин анти-А (α) обнаруживается примерно у 50%, изоагглютинин анти-В (β) - у 85% людей.