АГГЛЮТИНАЦИЯ

Расстановка ударений: АГГЛЮТИНА`ЦИЯ

АГГЛЮТИНАЦИЯ (позднелат. agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок корпускулярных частиц — бактерий, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, клеток тканей, корпускулярных химически активных частиц с адсорбированными на них антигенами или антителами, взвешенных в среде электролитов.

Антитела, вызывающие реакцию А., называют агглютининами, а антигены, участвующие в реакции, — агглютиногенами. Агглютинины называют обычно соответственно клеткам, к-рые взяты в реакцию. Так, напр., агглютинины против эритроцитов — гемагглютининами, против лейкоцитов — лейкоагглютининами и т. д.

Различают агглютинины полные и неполные. Реакция А. позволяет обнаруживать антитела в сыворотке крови, экстрактах тканей, секретах организма при инфекционных заболеваниях, при ауто-, изо- и гетероиммунизации (см. Группы крови, Иммуногематология), аллергических состояниях.

Реакция А. может быть специфической, неспецифической и спонтанной.

Специфическая реакция А. возникает под влиянием сывороток животных или человека (см. Антитела), иммунизированных различными антигенами (см. Антигены, Антиген — антитело реакция), или нормальных сывороток человека.

Неспецифнческая реакция А. возникает, когда агрегация и выпадение в осадок корпускулярных частиц происходит под влиянием изменения факторов внешней среды (рН среды, концентрации солей, повышения или понижения температуры и др.).

К неспецифической реакции агглютинации может быть отнесена реакция А. эритроцитов человека и животных (см. Гемагглютинация) под действием водных экстрактов из семян и плодов нек-рых видов растений.

Среди растений, гл. обр. бобовых, были обнаружены гемагглютинины, обладающие и специфической способностью агглютинировать эритроциты человека только определенных серологических типов. Антителам, содержащимся в солевых экстрактах плодов и семян многих видов растений (фитогемагглютинины), присущи свойства, наблюдающиеся у агглютининов специфических сывороток, полученных от иммунизированных животных. Эти фитогемагглютинины получили название лектинов (см.).

Спонтанная реакция А. наблюдается в случаях, когда бактерии при размножении не делятся на отдельные клетки, а остаются связанными между собой в цепи или гроздья. Такие суспензии не гомогенны. Часть культуры всегда находится в осадке. Под действием бактерий и вирусов эритроциты могут давать спонтанную А.

В инфекционной иммунологии реакция специфической А. применяется для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей, для изучения иммунного ответа организма при инфекции и профилактической иммунизации.

Впервые реакция А. бактерий была описана Шарреном и Роже (A. Charrin, G. H. Roger, 1890) и И. И. Мечниковым (1891). Практическое применение реакции А. было предложено Грубером, Дархемом и Видалем (М. Gruber, Н. Е. Durham, F. Widal, 1896) для диагностики брюшного тифа (см. Видаля реакция).

Реакция А. бактерий выполняется в пробирках в объеме 1 мл (макроскопическая развернутая реакция А.). В штатив устанавливается ряд пробирок с номерами. Во все пробирки, кроме первой, наливают изотонический раствор хлорида натрия, затем в первую и вторую пробирки вносят 1 мл иммунной сыворотки в разведении 1:100. После смешивания из второй пробирки забирают 1 мл сыворотки в разведении 1:200 и переносят в третью пробирку и т. д. Из предпоследней пробирки 1 мл разведенной сыворотки выливают. В последнюю пробирку сыворотку не вносят. В канадую пробирку добавляют по две капли густой взвеси изучаемых бактерий (2 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту) и энергично встряхивают. Последняя пробирка является контролем гомогенности культуры изучаемых бактерий. Количество антигена в каждой пробирке одинаково. Первая фаза реакции протекает при t° 37° в термостате в течение 2 час., затем 18 час. при комнатной температуре. Учитывают показания реакции А., как правило, невооруженным глазом. В последней, контрольной, пробирке должна быть равномерная взвесь бактерий.

Реакция А. оценивается следующим образом:

+ + + + полная агглютинация, жидкость прозрачна, культура в осадке;

+ + + неполная агглютинация, жидкость не полностью прозрачна, имеется осадок;

+ + слабая агглютинация, жидкость не прозрачна, имеется осадок;

+ следы агглютинации, жидкость не прозрачна, небольшой осадок;

— отрицательная реакция, во всех пробирках взвесь равномерно мутная, осадка нет.

За титр сыворотки принимается ее разведение, давшее реакцию А. на + + при полном отсутствии А. в контрольной пробирке.

Осадок, выпадающий при положительной реакции А., может иметь вид крупных рыхлых хлопьев или мелких компактных зерен. Крупнохлопчатый осадок образуют бактерии, имеющие два антигена: жгутиковый — Н-антиген и соматический — О-антиген (см. Бактерии, антигены бактерий). Крупные хлопья при полной А. выпадают в осадок в течение 2 — 4 час. Мелкозернистый осадок образуют бактерии, не имеющие жгутиков. Эти бактерии имеют только один соматический антиген. В процессе А. тела бактерий склеиваются и медленно (в течение 18 час.) выпадают в осадок.

С целью более точного определения степени проявления реакции А. применяют различные приборы: агглютиноскоп, фотоэлектрический денситометр, фотоэлектрический колориметр, спектрофотометр.

В практической работе применяется капельный метод постановки реакции А. в пробирках и на предметном стекле. Предложено несколько модификаций капельного метода постановки реакции А., начиная от смешивания неразведенной специфической сыворотки с равным количеством исследуемой бактериальной культуры до разведения сыворотки 1:400.

Результаты реакции А. на предметном стекле учитывают через 5 мин. при постоянном покачивании предметного стекла или через 30 мин., если предметное стекло находится во влажной камере. Реакция А. на предметном стекле чаще употребляется Как ориентировочная (см. Нобля реакция). Можно снять половину колонии изучаемой культуры бактерий с твердой питательной среды и в реакции А. на предметном стекле определить их вид. Реакция А. на предметном стекле полностью удовлетворяет цели исследования, если применяются адсорбированные монорецепторные сыворотки.

Часто специфические сыворотки, полученные от иммунизированных животных или больных людей, дают положительную реакцию А. не с одним предполагаемым возбудителем заболевания, а и с другими видами микроорганизмов. Так, напр., сыворотка больных брюшным тифом может агглютинировать в высоких титрах не только брюшнотифозную палочку, но и бактерии, вызывающие паратиф А и В (групповая А.). Это указывает на общность антигенов этих бактерий. Принято считать, что заболевание вызвал микроорганизм, к-рый агглютинируется сывороткой больного в более высоком титре, чем другие виды бактерий. Но различие титров в реакции А. нередко бывает незначительным, и в этих случаях применяют метод адсорбции агглютининов (см. Кастеллани метод). Он основан на том, что специфическую сыворотку насыщают несколькими культурами, к-рые агглютинируются этой сывороткой. В пробирке, где добавлена специфическая культура, адсорбируются все агглютинины, а там, где добавлена неспецифическая культура, адсорбируются только групповые агглютинины (специфические остаются свободными).

В целях повышения чувствительности реакции А. часто применяется пассивная реакция А. Сущность этой реакции состоит в том, что специфические антигены и антитела взаимодействуют на поверхности инертных частиц, к-рые при положительной реакции выпадают в осадок. В качестве корпускулярных частиц для адсорбции антигенов и антител были предложены различные адсорбенты, но для практического применения приемлемы только те, которые обладают высокой адсорбционной емкостью, однородностью частиц и наименьшей склонностью к спонтанной А. К таким адсорбентам относятся эритроциты человека и животных, частицы латекса, коллодия, бентанита и др.

Реакция пассивной А. с диагностической целью была предложена А. Т. Кравченко (1943) и М. И. Соколовым (1945). Эритроциты человека нагружались гаптенами, приготовленными из бактериальных клеток возбудителей инфекционных заболеваний. Эти эритроциты приобретали способность агглютинироваться под действием специфической сыворотки.

Предложено несколько модификаций пассивной реакции А. нагруженных нативных эритроцитов и реакция торможения пассивной А. нагруженных эритроцитов. Эритроциты человека и животных, предварительно обработанные таниновой к-той, приобретают способность в большей степени адсорбировать на своей поверхности белковые антигены (см. Бойдена реакция). Обработка эритроцитов таниновой к-той сближает их свойства с индифферентными частицами.

Для практических целей были предложены эритроцитарные диагностикумы — эритроциты, нагруженные антигенами различных видов бактерий или антителами. Эритроцитарные диагностикумы приготовляются для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры и других жел.-киш. заболеваний, а также чумы, коклюша, сыпного тифа. Кроме того, эритроцитарные диагностикумы применяются при исследовании природы аллергических реакций.

Практическое применение нашел так наз. латекс-тест. Частицы латекса являются промежуточным продуктом синтеза каучука. Взвесь частиц латекса размером 0,79—0,81 мкм выпускается специально для серологических исследований. Исходная взвесь латекса фильтруется для удаления частиц большего размера. Взвесь частиц латекса разводится в отношении 1:10 боратным или глициновым буфером (рН = 8,2). Приготовленную взвесь «нагружают» антигеном или антителами в соотношении 1:10 и выдерживают при t° 37° 2 часа.

Частицы латекса, нагруженные антигеном или антителами, можно использовать в реакции определения неизвестного антигена по известной сыворотке или по известному антигену определяют неизвестную сыворотку. Две капли разведенной буфером неизвестной сыворотки, предварительно прогретой при t° 56° в течение 30 мин., смешивают на предметном стекле с одной каплей нагруженных антигеном частиц латекса. Реакция наступает, как правило, быстро (2—3 мин.) и только в нек-рых случаях требуется выдержать 30 мин. при t°37°. Наступившая реакция А. частиц латекса хорошо видна невооруженным глазом на темном фоне или под малым увеличением микроскопа.

Реакция А. широко используется для обнаружения антиэритроцитарных антител, а также антигенов в эритроцитах (см. Группы крови).

Важное значение, особенно в последнее время, приобрела реакция А. лейкоцитов (лейкоагглютинация). При помощи реакции лейкоагглютинации производится типирование лейкоцитарных антигенов, имеющих большое значение в проблеме трансплантации (см.).

Для постановки реакции лейкоагглютинации используют сыворотки, полученные от многорожавших женщин, сыворотки больных после многократных переливаний крови, содержащие антилейкоцитарные антитела. Реакция А. лейкоцитов производится с лейкоцитами, полученными из крови или лимф, узлов (лимфоциты), ex tempore, т. к. лейкоциты, выделенные из крови, сохраняют жизнеспособность только 6 час.

При выделении лейкоцитов из крови необходимо принять все меры предосторожности, избегая повреждения клеток. Методы получения лейкоцитов из крови для реакции А. основаны на разной скорости оседания лейкоцитов и эритроцитов из дефибрированной крови. 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего 2,5 г желатины, 3 г лимоннокислого натрия и 3 г сахарозы, при смешивании с кровью в соотношении 10:3 осаждают эритроциты полностью в течение 30 мин. В надосадочной жидкости остаются лейкоциты и тромбоциты. Осторожное центрифугирование надосадочной жидкости при 800 об/мин в течение 4 мин. позволяет получить лейкоциты в осадке, а тромбоциты в надосадочной жидкости. Осадок, состоящий из лейкоцитов, отмывают раствором еще дважды.

Получение лейкоцитов должно производиться при низкой температуре и в условиях стерильности, т. к. бактериальное загрязнение взвеси лейкоцитов влечет за собой спонтанную А.

Для лейкоагглютинации рекомендуется использовать взвесь лейкоцитов, содержащую от 3000 до 5000 лейкоцитов в 1 мкл (подсчет в камере Горяева). Сыворотку перед постановкой реакции лейкоагглютинации прогревают при t° 56° в течение 30 мин.

Реакция проводится в пробирках, на стекле с лунками или на пластинах органического стекла с лунками. Реагирующие жидкости берутся в соотношении 0,1 мл разведенной сыворотки на 0,05 мл взвеси лейкоцитов.

Объем реагирующей смеси можно варьировать. Смесь выдерживают при t° 37° в течение 1 часа. Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле 3% раствора уксусной к-ты для удаления оставшихся при промывке эритроцитов. Реакцию лейкоагглютинации учитывают под малым увеличением микроскопа. Оценку показания реакции начинают с контрольной пробирки. Положительную реакцию оценивают, как обычную реакцию А. любых взвешенных частиц, по четырехбалльной системе.

Для изучения антигенного состава тромбоцитов (см.), а также обнаружения антитромбоцитарных антител в сыворотке больных после многократных переливаний крови применяют реакцию А. тромбоцитов. Сложность постановки реакции А. тромбоцитов заключается в получении в взвеси тромбоцитов без признаков спонтанной А. Для получения такой взвеси тромбоцитов важен выбор антикоагулянта (см.), а также особая обработка посуды, исключающая повреждение тромбоцитов, их прилипание к поверхности посуды и спонтанную А.

Для реакции рекомендуется брать взвесь тромбоцитов в концентрации 150000 — 250000 клеток в 1 мкл.

Готовую взвесь тромбоцитов (перед тем как смешать с сывороткой) отстаивают в течение 30 мин. Испытуемая и контрольные сыворотки предварительно прогреваются при t°56° в течение 30 мин. Реагирующую смесь помещают в термостат на 1 час. при t° 37°. Оценку реакции проводят под микроскопом при благополучном контроле по четырехбалльной системе. Однако более четкие результаты по изучению антигенного состава тромбоцитов получают при использовании реакции связывания комплемента (см.).

Реакция А. имеет две фазы. Первая фаза — специфическая, сводится к соединению антигенов бактерий, эритроцитов и других клеток, а также антигенов, адсорбированных на поверхности индифферентных частиц, с агглютинирующими антителами. Вторая фаза — неспецифическая, которая проявляется А. эритроцитов, бактерий, лейкоцитов, индифферентных частиц с нагруженным на них комплексом антиген — антитело.

Реакция А., в отличие от реакции преципитации, может быть положительной при очень больших разведениях сыворотки. Точное количество антител, необходимое для того, чтобы вызвать реакцию А., не известно. Показано, что общий объем продукта реакции А. всегда превышает исходный объем бактерий, но степень увеличения объема всегда различна и зависит от многих трудно учитываемых причин. Положительная реакция А. может быть вызвана количеством антител, во много раз меньшим, чем количество антител, способное адсорбироваться антигенами на поверхности клеток, бактерий или частиц. В нек-рых случаях при постановке реакции А. могут наблюдаться зоны задержки. Отсутствие А. при больших разведениях сыворотки называется постзоной, а при малых разведениях — прозоной. Было установлено, что задержка реакции А. при максимальном количестве специфических антител вызывается ингибиторами, к-рые снижают силы сцепления бактерий. Неагглютинирующиеся бактерии после отмывания их снова становятся агглютинабельными при больших разведениях той же сыворотки. Надосадочная жидкость содержит ингибиторы, которые могут снижать сцепление бактерий, обработанных сыворотками. Ингибиторы, вызывающие прозону в реакции А., имеют сходство с блокирующими антителами (см. Антитела).

Применение в научных исследованиях по иммунологии различных адсорбентов дало возможность моделировать процессы взаимодействия антигенов и антител на поверхности адсорбентов. Одной из удобных моделей для изучения закономерностей реакции А. являются эритроциты, нагруженные различными антигенами.

Было установлено, что взаимодействие нативных эритроцитов с полисахаридами кишечной палочки, возбудителем холеры, чумы и других бактерий подчиняется закономерностям хим. реакции.

В наст, время нет теории механизма реакции А., удовлетворительно объясняющей все известные экспериментальные данные (см. Антиген — антитело реакция). В литературе известны теория адсорбции Борде, теория решетки Маррака, теория окклюзии Бойда и др. Наибольшее распространение получила теория решетки, согласно к-рой предполагается, что антитела имеют не менее двух активных центров, способных соединяться с детерминантными группами антигенов. Молекула специфического антитела, соединяясь с детерминантами двух или более антигенов, образует решетку — агрегат, к-рый при наличии в среде электролитов выпадает в осадок. Реакция А. не происходит с неполными антителами. Считали, что неполные антитела имеют только один активный центр, следовательно, они могут только соединяться с антигеном, но не могут образовать агрегатов, к-рые выпадают в осадок. Высказано предположение, что неполные антитела тоже двухвалентные, но их активные центры расположены так близко друг к другу, что не могут одновременно соединиться с двумя молекулами антигена. Кроме того, известно, что обработка неполных антител или эритроцитов трипсином влечет за собой нормальное проявление второй фазы реакции А. Обнаружение неполных антител возможно с помощью реакции А.: эритроциты, сенсибилизированные неполными антителами, могут быть использованы как антиген, если на них подействовать специфической антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция).

Агглютинация в судебно-медицинском отношении — см. Группы крови.

См. также Серологические исследования.

Библиогр.: Адамов А. К. Принципы быстрого обнаружения патогенных микробов и вирусов, Саратов, 1964, библиогр.; Боид У. Основы иммунологии, пер. с англ., с 274, М., 1969; Говалло В. И. Реакции, основанные на феномене агглютинации, в кн.: Лабораторные методы ислепования в неинфекционной иммунологии под ред. О. Е. Вязова, с. 73, М., 1967; Гостев В. С. Реакция антиген — антитело, Многотомн. руководство по микробиол., клин, и эпидемиол. инфекц. болезней под ред. Н. Н. Жукова-Вережникова, т. 3, с. 117, М., 1964, библиогр.; Косяков П. Н. Иммунология изоантигенов и изоантител, М., 1965, библиогр.; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ.,с. 106, М., 1968; Heidelberger М. a. Kabat Е. А. Chemical studies on bacterial agglutination, J. exp. Med., v. 65, p. 885, 1937, bibliogr.; Metchnikoff E. Études sur l'immunité, Ann. Inst. Pasteur, t. 5, p. 465, 1891; Niсо11e C. Recherches sur la substance agglutinée, ibid., t. 12, p. 161, 1898; Thompson R. a. Buchbinder L. Flocculation of vaccinial virustissue suspensions by specific antisera, J. Immunol., v. 21, p. 375, 1931, bibliogr.

А. Т. Кравченко.

Источники:

1. Большая медицинская энциклопедия. Том 1/Главный редактор академик Б. В. Петровский; издательство «Советская энциклопедия»; Москва, 1974.- 576 с.